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突变株

在核苷酸链特定位点的核苷的永久性改变
突变是指在核苷酸链特定位点的一个或多个核苷的永久性改变。而发生突变的菌株就称为突变株。突变可能涉及到染色体上一个或多个核苷对的替换、删除或重排,这种突变称为点突变。DNA的错误聚合可能会使突变率提高。通常基因在任何一点发生突变的概率是很低的(10-5-10-10/代)。并且,在大多数情况下突变是有害的,但是特定的突变往往会使微生物更好的适应环境和改进其本身的生物催化性能。因此,困难在于分离那些有优良特性的突变株。
中文名
突变株
外文名
mutant
定    义
发生一个或多个突变
载    体
生物群体基因染色体

定义

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mutant
因发生一个或多个突变而不同于相应野生型的任何生物生物群体基因染色体

应用

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微生物突变株在遗传学研究、基因工程技术和育种中有广泛的应用。

类型

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其类型包括章和:(1)形态突变株,如影响细胞结构细胞挨道订形态菌落形态噬菌斑润抹询形态等的突变株;(2)生理生化突变株,如营养缺陷突变型和影府拒背妹响的分解利用或色素的产生等突变株;(3)抗性突变钻枣敬体汽株,如耐药性噬菌体抗性紫外线抗性等突变株。(背兵堡4)条件致死突变株,如温度敏朵乌榜感突变株等。

基因突变

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定点突变
突变,在生物学上的含义是指细胞中的遗传基因(一般指DNARNA,对动物而言包括细胞核与线粒体中的,植物则还包括叶绿体中的)发生永久的、可遗传的改变。
基因突变分为自发和诱发。原因可以是细胞分裂时遗传基因的复制发生错误、或受化学物质射线、或病毒的影响。一般具有四种特征:1,突变的重演性和可逆性;2,突变的多方向性和复等位基因。3,突变的有害和有利性;4.,突变的平行性。
突变通常会导致细胞运作不正常、或细胞死亡,甚至可以在较高等生物中引发癌症。但同时,突变也被视为物种进化的推动力:不理想的突变会经天择过程被淘汰,而对物种有利的突变则会被累积下去。中性的突变对物种没有影响而逐渐累积,导致间断平衡。

密度突变株

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指因病毒粒子中所含有的核酸量的增减而引起病毒粒子的飘浮密度发生变化的突变株。λ,T7等噬菌体DNA发生部分缺失而变短时,若缺失部分不含有必不可少的信息,则也能形成感染粒子。也有因整合了宿主菌的DNA片断而分子量变得比野生型更大的。虽然这些噬菌体粒子的DNA含量不同,但外壳蛋白质的量是一定的,所以它们的密度与野生型噬菌体的密度不一样。用氯化铯之类的密度梯度离心法能分离出相应的DNA含量不同的各种粒子。

酵母突变株筛选

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材料与方法

1.1材料
筛选突变株
1.1菌株和质粒大肠杆菌菌株DH5α为本室保存;酵母菌株INVSc1购自Invitrogen公司,其遗传型与表型Genotype:MET/METahis3△1/his3△1leu2/leu2trp1-289/trp1-289ura3-52/ura3-52Phenotype:His,Leu,Trp,Ura.pHSS6酵母-大肠杆菌穿梭质粒(在pHSS6的插入片段中含有mTn-3xHA/lacZ同源重组子)由美国Yale大学SnyderM教授惠赠。
1.2方法
1.2.1铺板,用50μg/mL卡那霉素或/和3μg/mL四环素筛选抗性克隆,37℃12~20h。以LB洗下克隆,适当稀释,部分以甘油冻存.适当稀释后,接种于50mLLB-50μg/mL卡那霉素和/或3μg/mL四环素,37℃培养6h至指数生长期。
1.2.2质粒的提取、纯化及检测常规方法中提或大提质粒,纯化质粒,电泳分析,紫外分光光度计OD260/280检测。部分经酒精沉淀保存。
1.2.3酵母转化取3μg纯化的质粒,经NotI内切酶消化(根据内切酶附说明书),电泳,培养10mLINVSc1酵母菌至指数生长期(30℃,36~48h),OD600=1,离心收集细胞,以5mL转化缓冲液清洗一次(转化buffer:0.2mol/LLiAC,40%PEG4000,100μmol/Lβ-ME(巯基乙醇))。将细胞重新悬浮于1mL转化缓冲液中,含1mg变性鲑鱼精子DNA,混匀后,100μL/管分装于新的Eppendorf管中,每管加入以NotI消化后的质粒DNA0.5μg,彻底混匀后,于45℃,孵育30min。细胞经离心收集,悬浮于400μL的SC-ura,用200μL铺板,于30℃,2d。
1.2.4LacZ基因的表达为检测LacZ基因的表达,将克隆挑选出来,铺片于YPAD平板中,每板的密度为100个铺片。以无菌滤纸,将上述平板复制于另一SC-ura平板上,37℃过夜。将滤纸取出,克隆面朝上,置于一密闭容器中。容器底部加入10mL氯仿,10~30min。取出滤纸,克隆面朝上,置于X-gal平板(120gX-gal,0.1mol/LNaPO4(pH7),1mmol/LMgSO4,于1.6%琼脂平板中),30℃,2d。查找X-gal阳性的克隆,从YPAD平板上重新挑取单克隆在SC-ura平板上,进行划板培养。将扩增的酵母菌种进行冻存保存(-80℃)。取LacZ表达最强的菌株进行大规模培养。

结果

基因突变
2.1转化株的SC-ura培养基上的生长情况由于发生同源重组后的转化子含有tetr抗性基因及酵母营养缺陷型选择标记Ura3,因此可以通过SC-ura或tetr,选出我们所需的转化株。
2.2LacZ基因的表达
若插入片段与酵母基因组读码框相匹配,LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶N端与宿主编码的C端结合,产生生物活性与X-gal反应,生成蓝色。
2.3酶切后的电泳图
纯化的质粒,经NotI酶解,应可见一条2.1kb左右的较均一的条带(载体pHSS6)和较不均的DNA插入片段条带(约8kb,含有mTn-3xHA/LacZ)。

实例-突变品系

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肌萎缩症小鼠

(DystrophiaMuscularis简称dy)或称肌失营养症即后肢瘫痪小鼠
该鼠与人类有相似的肌萎缩症状,其dy/dy大约出生两星期可见后肢拖地,表现有进行性肌衰弱和广泛性的肌萎缩。病鼠出生时是活的,但只有少数病鼠能存活10周以上,无繁殖力。但已证明dy/dy雌鼠的卵巢移植到正常雌鼠体内是具有生殖能力的。由于雌本基本不育。因交配无能,且母性不好,一般和留杂合型,如雄鼠与正常雌本交配有困难,可人工受精,也可卵巢移植。常用的有REJ129/dy后肢偏瘫小鼠。

肥胖症鼠

(Obese,简称ob)
实验小鼠
肥胖症鼠有肥胖小鼠(ObeseMice)和肥胖大鼠(ObeseRat)。肥胖小鼠体重可达60克,这种小鼠无生育力,表现为单纯胖而不伴有糠尿病纯合体大约在四周龄时即可识别出,此时其增重加速,很快可达到正常同窝鼠体重的3倍。中等程度的摄食过度可使其几乎不太活动,但在幼年时其血糖和免疫活性胰岛素并不明显增加,5~6月龄以后,肥胖趋向稳定,胰岛素和葡萄糖水平上升,这些小鼠不受外来胰岛素的影响,但节制食物可增加对胰岛素的敏感性以及延长其寿命。所有的雌鼠均无生殖力。卵巢和子宫萎缩,若坚持节制饮食,则雄鼠偶尔能够繁殖。Langerhans岛的增生与胰岛素分泌增加有关,肾小球发生肾结节状脂肪玻璃样病变,在电镜下可见了其局限于肾小球膜和基膜的内皮面。肥胖小鼠的皮下、后腹膜和性腺的脂肪增多,这是脂肪细胞数目增多和体积增加的结果,因此被称为肥大性一增生性肥胖症。
这种小鼠的肥胖症与人类的肥胖症很相似。利用这种小鼠曾进行了许多有益于肥胖症的生化、病理、激素及药物治疗等的研究。因为这种鼠无生育力,所以必须用杂合子交配以保持此基因。Ob/+和+/+很难区别,表现完全一样,用其交配要花费很长时间才能辨别。这种突变小鼠的维持很困难。若节制饮食使体重下降,则其维持种系的效果不好,亦可从肥胖鼠的卵巢取卵子移植于+/+鼠进行繁殖。除ob突变型外,后来又发现ad即成年肥胖和糖尿症(Adultobesityanddiabetes)。ad/ad型的肥胖症体重相当于正常鼠的两倍,与ob/ob型一样,通常不育,7-10周龄时表现出高血糖和糖尿症。 在新西兰小鼠中也表现一种肥胖症叫NZO(NewZealandObese)。该鼠通常具有生殖能力,所有的小鼠均发生肥胖,但脂肪沉积主要是在腹内,于2~4月龄时即可发现脂肪沉积,最终达到总体重的70%,高血糖不明显,但胰岛素的水平升高。在快速增重期间,食物的摄入量明显的增加。此外,还有一种肥胖Fatty,基因符号为fa,肥胖同时有糖尿病,受孕率低。日本KK小鼠也发生肥胖。从小鼠的肥胖症知道,肥胖症有不同的遗传型。这对研究人类肥胖症的一系列问题颇有助益。

侏儒症鼠

(DwarfMice,简称dw)或称矮小畸形鼠
这种畸形又称垂体性侏儒症(PituiaryDwarfism),因为其缺乏脑下垂体前叶的生长素促甲状腺激素,故使生长发育障碍。纯合子dw/dw小鼠在12~13月龄时即可被识别,它表现为短尾和短鼻,到成熟年龄时,其体积约为同窝正常鼠的1/4,8周龄时体重为8~10克,尽管多数能存活到成熟期,但雄鼠和雌鼠均无生殖力,可出现继发的粘液性水肿。给病鼠食入垂体前叶碎片可以使生长速度基本正常。由于该鼠无生育能力,两性均不育,所以只能用杂合子把基因保留下来,这样只能得到25%的矮小畸形鼠于,9月鼠龄时将正常垂体移植到这种鼠的肾脏,在雄鼠可长大到近于正常小鼠体形并可繁殖(但在雌鼠收不到效果,原因不明)。这种突变型小鼠在内分泌研究上有较大用处,如对“生长素”等进行分析研究等。

糖尿病鼠

(Deabetes,简称db)
由Hummel等(1966)最先报导,它是由单隐性突变基因引起,自发于Jackson实验室的近交系小鼠(C57BL/Ks),该基因(db)与肥胖(ob)不是等位基因,尽管它们的表现型特征相似,db/db基因鼠的第一个表现是当病鼠到3~4周龄时,腋和腹股沟皮下组织出现脂肪的异常沉积,此时血糖升高,从200mg/100ml血以下的正常水平上升到一年龄时的682mg/100ml血(平均为563.2mg/100ml血)。雌鼠无生殖力,但其卵巢移植到其它鼠后仍能恢复生殖活性。多数鼠不能存在到8个月以上,但若在病的早期节制饮食则可延长其生命。临床症状包括肥胖、高血糖、糖尿、蛋白尿、烦渴、多尿,最后可因酮尿而死亡。死后变化包括胰岛细胞中具有很少β颠粒和胰管肿胀。Like(1972)描述了db/db小鼠肾小球的变化,在外形上与同龄正常小鼠的一样,但比后者大得多,小鼠到了糖尿病发病年龄时,肾小球膜变化更加明显,外周基层持续增厚,并生有许多小结,还认为多尿可能是高血对肾小球产生利尿作用的结果。

骨骼硬化症鼠

(Ostepetrosis,简称op)
实验小鼠
发生于侏儒症(dwarf)小鼠。这个隐性基因(op)位于第12号染色体上。大约10日龄时(op/op)即可识别出,其头呈圆顶状,脚短,门齿缺如,主要的骨骼缺陷是骨重建不良造成的,在出生前后6周最明显、随着小鼠的成长,骨形成减速,重建时骨的消除与形成的速度几乎相等,因此症状表现比较微,病鼠的破骨细胞较同窝正常鼠为小,酸性磷酸酶出现于整个细胞,而不是仅集中在破骨细胞和骨头的界面上。op/op小鼠的长骨受到的影响最大,至少在出生后的6个月里,骨髓腔闭合,出现原始的海棉骨,病鼠的骨片似乎比同窝正常鼠密实,当病鼠到6~10月龄时骨髓腔重新出现,并充满正常的造血成分,其中巨核细胞的数目增多。与其它骨硬化突变体不同,它们不伴随色素异常,因此不同于小眼畸形(Microphthalmia)mi/mi;和灰色-致死(Grey-Lethal)gl/gl小鼠。op/op突变体生存的时间较长,骨骼的病变可随小鼠的成长而消失,在骨骼病变消除前,骨基质形成和甲状腺滤泡旁细胞水平的比率大幅度下降。
由于病鼠骨质生长异常,骨质硬,骨髓腔消失,所有骨骼都硬化,并伴有无齿症。因此往往在同窝仔鼠中发现死亡仔鼠。第二窝才出现断奶后死亡的小鼠无牙齿,系因不能吃食而死亡,但于断奶后喂软饲料可保留下来。op为隐性基因,无齿型发生于肥胖型父母,第二代出现无齿。正常时上下颌骨有牙齿的主要发点,骨硬化症时有生长牙齿的生发点,但因骨质硬而不能长出。这种鼠的病变的与人类大理石骨病相似。
治疗方法有:
1.联体生活(Parbiosis):可使部分动物得到治疗,一个月可治愈。
2.骨髓移植(BoneMarrowGrafts):对人类用此种方法。此病病因不明,病人造血机能发生变化。此种动物可用作研究人类骨髓硬化症的模型。

显性斑点突变贫血鼠

(DominantSpotting)因为斑的大小是指白斑(WhiteSpotting)大小,所以缩写为W。正常时是小写w w,当呈W W时则表现出贫血。在W处有五个等位基因,任何两个等位基因都可引起严重的大红细胞性、发育不全性贫血,同时引起肝脏造血功能障碍。贫血的严重性受环境和基因型影响。可出现不同类型的突变体,如W/+,W v/ +,Wv /W v,W /W v , W/ WJ , WJ , W N等。这些突变体均无生育力,表现为黑眼,白色。
W W出生后只能存活几天,当有修饰基因存在时,则Ww呈部分显性,可出现90~98%白斑;如无修饰基因存在,则呈现纯白,但为黑眼;如有一些修饰基因存在可出现不同程度的花斑。W是一组复等位基因,如Wv的v是Viable(活)的意思。W v W v可活到成年,为白色、黑眼,通常是不育的,偶然表现出有限的生育力,其红细胞只有正常的半数,与人类贫血相似。
用于造血系统研究的突变小鼠有:
1.W突变(DominantSpotting)小鼠
⑴W / W v:遗传性贫血小鼠,能活到成年,如WBB6F1/J- W /W v小鼠。
⑵+/ +:非贫血小鼠,红细胞计数正常,如WBB 6F 1/J-+ /+小鼠。
⑶W / W:遗传性贫血小鼠,造血干细胞正常,是造血微环境发生缺陷的小鼠。
⑷W / W a:遗传性贫血小鼠,造血微环境正常,是造血干细胞发生缺陷的小鼠。
2.an突变(Hentwig′sAnemia)小鼠。
大红细胞性贫血,贫血严重程度随遗传背景不同而异,妊娠的第12天开始发生的造血功能缺陷,伴有白细胞减少症。
3.f突变(Flexed-Tail)小鼠:
高铁红细胞性贫血,贫血变化是由于胎儿肝脏造血障碍所致,因此出生时即发生贫血。此种小鼠,表现为尾弯曲。
4.JO(Joundice)突变小鼠,妊娠第14天出现贫血,出生后几小时出现黄疸,新生期常因脑受损、黄疸、胆红素毒血症或缺氧症而死亡,血循环中出现小网状红细胞和有核红细胞。
5.ha(HemolyticAnemia)突变小鼠:新生期溶血性贫血,多于妊娠14天时出现。新生期黄疸,多数死于出生后的一周内。
6.Sph(Spherocytosis)突变小鼠:有溶血性贫血、球形红细胞症、胆红素过多血症,出生后短期内死亡。
7.Sla(Sex-LinkedAnemia)突变小鼠:表现为轻度贫血、网状红细胞症、骨髓缺乏。两性生长均受阻,但能存活。
8.dm(Diminutive)突变小鼠:dm/dm鼠体小、尾短且扭曲,肋骨和骶骨前脊椎增加,脊椎畸形,肋骨节融合,大细胞性贫血。
9.Ts(Tail-Short)突变小鼠:Ts/Ts小鼠常死于子宫中,到妊娠的第8天,表现为尾短且扭曲以及其他骨骼异常,生前贫血以及卵黄囊造血障碍,贫血还可导致其它异常。

白内障突变鼠

(Catarct,简称Cat)
这是显性遗传,10月龄至14周龄时晶状体混浊,还会发生晶状体液化和核的上超咬合。当Cat呈杂合状态时出现白内障。这种性状在一般情况下很容易观察到,可作为眼科的动物模型。

无脾突变鼠

(Asplenia,简称As)
该鼠脾脏完全缺如,它作为一个遗传性疾病出现于显性半肢畸形的杂合子小鼠。这些小鼠已被广泛应用于脾脏功能的研究,也是研究中医中药的重要动物模型,还是研究血吸虫病的良好实验材料。

灰色致死突变鼠

(Grey-Lethal,简称Gl)
gl/gl突变鼠除显纯灰色外,很主要的性状是生长障碍,出现14天后即比正常为小。牙不萌、形态不正常、牙齿不钙化。肢体长骨不正常。一般死于22~30日龄,利用其骨骼系统的障碍,有人用作锶的代谢研究。

视网膜退化突变鼠

(ReinalDegeneration,简称rd)
此种病鼠与人类的色素性视网膜炎相似,人类的色素性视网膜炎也是一种遗传病,呈现进行性视网膜硬化,有色素沉着及视网膜血管闭锁萎缩。人类这种病例很难取得标本进行病理等研究,而动物模型则提供了极为理想的实验材料,还可进行其它一系列研究。

淡化致死基因突变鼠

(Dilte-Lethal,简称aL)
dLdL除淡化的性状外,还有惊厥、瘫痪,大约死于生后三星期。后来有人发现这种病的苯丙氨酸氢氧酶的活性大大下降,因此此模型相似人类的苯酮尿病

针尾突变鼠

(Pintail,简称Pt)
当Pt+杂合状态就呈现显性突变性状,见削短与卷曲的尾巴,且椎间盘逐龄产生快速退化,这就类似人类的椎间盘突出症,可用于这方面研究。

少趾症突变鼠

(Hypodactyly,简称Hd)
该鼠两前肢有足趾各2个,两后肢有足趾各4个。雄鼠少趾症同时出现精子缺乏(OIigospermia)。雌鼠生育力正常。少趾与精子缺乏相关共存是一个有兴趣的现象。裸鼠亦有类似情况。无毛时生育力低下,其中关系尚未搞清。可能与多型性(Pleomorphic)基因或伴性(Sexlinkage)基因相关。只见于小鼠和大鼠,原因不明。

高血压突变型大鼠

(HypertensionRat)
高血压大鼠生育力强,对寿命也明显影响,可养13-14个月,Okamoto培育了许多亚系,以SHR最为名贵。
SHR(SpoataneouslyHypertensiveRats)即自发性高血压大鼠,是由Okamoto和Aoki选育成功的。正常大鼠收缩压110-120mmHg,开始用♂145-175mmHg×♀130-140mmHg作为亲代,以后兄妹交配。育成的高血压大鼠出生后5周血压可达150mmHg,而成年雄鼠的血压达200mmHg,其特点是高血压自发率为100%,血压平均170-180mmHg,最高达200mmHg,并有高血压性心血管病变。繁殖时每代都要选血压高的动物(高于180mmHg)作为繁殖鼠种。

癫痫突变型大鼠

(AudiogenicSeizures声源癫痫发作)
用铃响声刺激会旋转起舞数秒钟,然后一侧倒地发作癫痫,与人类癫痫相似。可用此种鼠作动物模型来研究人类癫痫病。中国医学科学院生理研究所和北医均有饲料